扶芳藤提取物对局灶性脑缺血大鼠脑组织IL-6 含量的影响

扶芳藤提取物对局灶性脑缺血大鼠脑组织IL-6 含量的影响

肖健 王坤 肖艳芬 祝美珍 黄燕

(广西壮族自治区南宁市广西中医学院 广西南宁 530001)

【摘要】

目的 探讨扶芳藤提取物对大鼠急性脑缺血再灌注损伤过程IL-6表达的影响。

方法 取Wistar大鼠随机分为假手术组、模型组和用药组,Longa法制作大鼠急性脑缺血再灌注损伤模型,用酶联免疫标记法测定脑组织与血清中IL-6的浓度。

结果 扶芳藤提取物能降低再灌注3h、6h、12h、24h后大鼠脑组织与血清中IL-6的表达。结论 扶芳藤提取物对大鼠急性脑缺血再灌注损伤的保护作用可能与其抑制脑组织与血清中IL-6的过度表达有关。

【关键词】扶芳藤提取物 脑缺血 IL-6

【中图分类号】R743.31

【文献标识码】A

【文章编号】1674-0742(2008)07(a)-0025-02

表 1 扶芳藤提取物对缺血再灌注不同时间点大鼠脑组织中IL-6 含量的影响( ± s,pg/mL)

注：与假手术组比较,*P <0.01;与缺血再灌注组比较,▲P<0.0126

脑缺血损伤的影响因素很多,包括内源性谷氨酸的大量释放、神经细胞内钙离子的超载、凋亡因子的表达失控、线粒体的损伤等。此外,包括IL-6在内的多种细胞因子参与了脑缺血损伤中的炎症反应,并在再灌注损伤过程中发挥着关键作用。本实验通过线栓法制备大鼠急性脑缺血再灌注模型,利用扶芳藤提取物预防给药并观察其对再灌注损伤过程中的IL-6水平的影响,以期进一步了解扶芳藤在治疗脑缺血疾病中的作用。

1 材料与方法

1.1 药物的制备

取扶芳藤1kg,加入相当干药材10倍量的水,在不锈钢锅内煮开后 1h,过滤,保留滤液;药渣再加以 8 倍于生药量的水,煮开后文火煎 30min,过滤去渣,合并 2 次滤液,浓缩至相当于原生药量的容量即1000mL时,取出冷却;然后加入95%食用乙醇,边加边搅拌,直至药液中含乙醇为80%时,放置48h,在前24h内搅拌3～4次,后静置24h,过滤去渣,滤液在旋转回收器中回收乙醇至无醇时,将无醇的液体加热,浓缩成2.0g生药/mL 的药物,保留于4℃冰箱,使用时再用双蒸水稀释成所需浓度。

1.2 给药方式及途径

药物组给予扶芳藤提取物灌胃,每100g大鼠每日药量为2mg,1 次/d,共 2 个月。各组最后一次给药均在手术前 1h 进行。

1.3 动物与分组

Wistar大鼠96只,雌雄各半,3～5月龄,体重250～300g,由广西医科大学动物实验中心提供,许可证号:SCXK桂2003-0003。随机分为3组:①假手术组;②脑缺血再灌注模型组(以下简称模型组);③脑缺血再灌注给药组(以下简称给药组)。以上各组均按缺血再灌注3h、6h、12h、24h4个时点分成4 个亚组,每个亚组8 只大鼠,分笼饲养,自由进食,喂标准颗粒饲料,饮自来水。

1.4 动物模型的制作

采用改良Zea Longa′ s法[1]制作大脑中动脉闭塞(middle cere-bral artery occulusion,MACO)模型。 大鼠用10%水合氯醛(0.35mL/100g)腹腔注射麻醉,仰卧固定,颈部正中线切口,沿胸锁乳突肌内缘钝性分离肌肉和筋膜,直到分离出左侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉,用动脉夹暂时夹闭颈内动脉,结扎颈外动脉近心端及颈总动脉,然后在距颈总动脉近分叉 3～4mm 处剪口,将直径为0.235mm的钓鱼线自切口轻轻插入,插入深度约为(18.5±0.5)mm,缝合皮肤,皮外留线长约 10mm。缺血 2h 后,将钓鱼线向外轻轻拨出10mm,即可实现再灌注。大脑中动脉闭塞(MACO)模型制作成功的标准:大鼠苏醒后表现为:①提尾离地时右前肢内收屈曲;②在地板爬行时向右侧划圈;③站立时向右侧倾倒。假手术组按上术方法施行,但仅分离至颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉后即施行缝合术,不插入钓鱼线。

1.5 标本收集

每只模型成功的大鼠按不同缺血时间点分明过度麻醉,开胸暴露心脏,将灌流针头经左心室插入主动脉,先后快速灌入200mL含有 0.01% 肝素的生理盐水及 200mL4% 多聚甲醛固定液。断头取脑,切开两半球,距额极2.5mm 向后切取 2.5mm 的损伤侧脑组织,用电子秤称重后放入玻璃匀浆器,加入10 倍于脑组织重量的4%多聚甲醛进行组织匀浆,将匀浆以2000r/min转速离心10min,取上清,封存,置-20℃冰箱待测。

1.6 指标检测

IL-6 的测定采用双抗体夹心间接酶联免疫吸附法，ELISA),ELISA试剂盒购自深圳晶美生物工程有限公司,严格按照试剂盒说明书进行操作。各组实验数据以均数±标准差(- χ ±s)表示,组间采用t检验,用SPSS14.0 for Windows软件进行统计。P<0.05为组间差异具有统计学意义。

2 结果

扶芳藤提取物对缺血再灌注不同时间点大鼠脑组织中IL-6含量的影响见表1,与假手术组比较,缺血再灌注 3h、6h、12h、24h模型组脑组织中IL-6含量明显升高。与模型组比较,扶芳藤提取物可降低缺血再灌注3h、6h、12h、24h 组 IL-6 水平。

3 讨论

IL-6是一种糖蛋白,其分子量介于21～28kD之间,多种淋巴样细胞和非淋巴样细胞如T细胞、B细胞、单核细胞、血管内皮细胞、肝细胞、纤维母细胞、成骨细胞均能产生IL-6,颅内IL-6

的主要来源常被认为是中枢神经系统(CNS)中的星形胶质细胞[2]。IL-6的表达在脑组织损伤过程中发挥着双重作用,正常生理浓度或低水平表达的IL-6对神经元具有保护和促进修复的作用,但快速的IL-6含量增高则可加剧神经元、胶质细胞及内皮细胞的损伤[3]。Wang等[4]

通过对大鼠缺血皮质IL-6、c-fos,及zif268mRNA的表达研究发现,MACO 后 IL-6-mRNA 的表达,3h 显著增加,12h 达到顶峰并持续到24h;提示IL-6可依此时间段增加蛋白质分子的表达并参与炎症反应。本实验中缺血再灌注模型组 IL-6在不同时点的表达与文献资料相似,并提示缺血再灌注损伤可能与IL-6 的持续高表达有关。

扶芳藤是卫矛科卫矛属植物,主要分布于我国西南各省区,具有止血化瘀、舒筋活络的功能,近年来被证实对脑缺血再灌注损伤有一定的拮抗作用,祝美珍等[5]实验表明扶芳藤合剂预防给药能对抗脑缺血再灌注损伤过程中c-fos蛋白的表达,肖健等[6]则表明上述合剂能拮抗TNF-α的产生。本实验结果表明,扶芳藤提取物预防给药后,大鼠脑缺血再灌注 3h、6h、12h、24h 的脑组织中的IL-6含量下降,提示其有减缓大鼠脑缺血再灌注损伤的可能性,但由于大鼠脑缺血再灌注过程中引起IL-6表达的因素很多,并且IL-6引起脑组织损伤的机制尚不明朗,因此扶芳藤提取物对脑组织的保护作用还需进一步研究。