扶芳藤提取物预防给药对大鼠急性脑缺血再灌注后c-fos表达的影响

扶芳藤提取物预防给药对大鼠急性脑缺血再灌注后c-fos表达的影响

肖 健

(广西中医学院微生物学与免疫学教研室,南宁市 530001 )

=摘要> 目的 探讨扶芳藤提取物预防给药对大鼠急性脑缺血再灌注后大脑c-fos表达的影响。方法 Longa法制作急性脑缺血再灌注损伤模型,用免疫组化法检测脑组织缺血再灌注2、6、12、24 h的c-fos表达水平。

结果 扶芳藤提取物能降低再灌注2、6、12、24 h后大鼠脑组织中c-fos的表达(P<0. 05)。

结论 扶芳藤提取物对大鼠急性脑缺血再灌注损伤的保护作用机制可能与下调缺血脑组织中c-fos表达有关。

=关键词> 扶芳藤提取物;脑缺血再灌注损伤; c-fos

=中图分类号> R 743. 31;R 289. 5 =文献标识码> A =文章编号> 0253-4304(2007)10-1501-02

Effect of Euonymus fortunei extract on the expression ofc-fos in ratswith cerebral is chem ia-reperfusion injury XIAO Jian(Department ofImmun obiology and Microbiology,Guangxi Tradictional Chinese Medical University,530001China)

=Abstract> Objective To study the effect of extract of Euonymus fortunei (EE) on the expression of c-fos in cerebral ischemia-reperfusion injury rats.M ethods The cerebral ischemia-reperfusion model was prepared by means of Longas' method.The expression of c-fos

were determined by immunohistochemistry.Results The expression of c-foswere decreased in allEE-treated groups after ischemia followed by 2,6,12,24 hours reperfusion.Conclusion The protection ofEE to neuronal injury induced by cerebral ischemia-reperfusion may work by down regulating the expression of c-fos. =Key words> Eutract;Euonymus fortune;i Cerebral ischemia-reperfusion injury; c-fos

扶芳藤[Euonymus fortunei (Turcz. ) Hand#Mazz]是卫矛科卫矛属植物,主要分布在我国山西、陕西、广西、云南、贵州、湖南、湖北等地,具有补肾强筋,止血化淤、舒筋活络的功能。

多年来国内对扶芳藤的研究从未间断,并证明扶芳藤能抑制血栓形成、增进超氧化物岐化酶(SOD)活力、延长心肌缺氧的存活时间[1]。本实验通过线栓法制造大鼠急性脑缺血再灌注

模型,利用扶芳藤提取物预防给药并观察其对再灌注损伤过程中的c-fos表达水平的影响,为进一步开发利用扶芳藤治疗脑缺血疾病探索理论依据。

1 材料与方法

1. 1 药物与试剂

扶芳藤的提取:取扶芳藤1 kg,加入相当干药材10倍量的水,在不锈钢锅内煮开后1 h,过滤,保留滤液;药渣再加以8倍于生药量的水,煮开后文火煎30min,过滤去渣,合并2次滤液,浓缩至相当于原生药量的容量即1 000 ml时,取出冷却;然后加入95%食用乙醇,边加边搅拌,直至药液中含乙醇为80%时,放置48 h,在前24 h内搅拌3~4次,后静置24 h,过滤去渣,滤液在旋转回收器中回收乙醇至无醇时,将无醇的液体加热,浓缩成2. 0 g生药/ml的药

物,保留于4e冰箱,使用时再用双蒸水稀释成所需浓度。c-fos免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。

1. 2 给药方式及途径

药物组给予扶芳藤提取物灌胃,灌胃量根据成人每日临床用量按人与动物之间药物剂量换算:利用mg/kg折算mg/m2转换因子进行计算[2],每100 g大鼠每日药量为2 mg, 1次/d,共2个月。

1. 3 动物与分组

W istar大鼠60只,雌雄各半, 3~5月龄,体重250~300 g,由广西医科大学动物实验中心提供,许可证号: SCXK桂2003-0003。随机分为3组:假手术组、脑缺血再

灌注模型组(以下简称模型组)、脑缺血再灌注给药组(以下简称给药组),以上各组均按缺血再灌注2、6、12、24 h四个时点

分成4个亚组,每个亚组5只大鼠,分笼饲养,自由进食,喂标准颗粒饲料,饮自来水。

1. 4 动物模型的制作

采用改良Zea Longa,s法[3]制作大脑中动脉闭塞(middle cerebralartery occulusion,MACO)模型。大鼠用10%水合氯醛(0. 35 ml/100 g)腹腔注射麻醉,仰卧固定,颈部正中线切口,沿胸锁乳突肌内缘钝性分离肌肉和筋膜,直到分离出左侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉,用动脉夹暂时夹闭颈内动脉,结扎颈外动脉近心端及颈总动脉,然后在距颈总动脉近分叉3~4 mm处剪口,将直径为0. 24 mm的钓鱼线自切口轻轻插入,插入深度约为(18. 5?0. 5)mm,缝合皮肤,皮外留线长约10 mm。缺血2 h后,将钓鱼线向外轻轻拔出10 mm,即可实现再灌注。

大脑中动脉闭塞(MACO)模型制作成功的标准:大鼠苏醒后表现为: (1)提尾离地时右前肢内收屈曲; (2)在地板爬行时向右侧划圈; (3)站立时向右侧倾倒。假手术组按上术方法施行,但仅分离至颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉后即施行缝合术,不插入钓鱼线。

1. 5 脑片制备

大鼠经10%水合氯醛(0. 35 ml/100 g)腹腔注射麻醉后,仰卧固定,常规胸腹联合切口,将灌流针头经左心室插入主动脉,快速灌入200 ml含有0. 01%肝素的生理盐水,接着滴注400 ml4%多聚甲醛固定液。灌流瓶内的液面应距离动物心脏约高出1 m以使灌流压略高于动物收缩压。灌流后将动物放入装有4%多聚甲醛固定液的塑料袋中,置4e冰箱内1 h,取出断头取脑,大脑置4%多聚甲醛固定液中固定2 h。大脑分别置于20%、30%蔗糖的PBS中(4e)过夜。次日以冰冻切片机切片,每个鼠脑约切10片,切片厚度为20Lm,切片贴附于聚赖氨酸载玻片。保鲜膜密闭片盒,置于-20e保存。

1. 6 指标检测

c-fos表达的检测采用免疫组化染色法,严格按照试剂盒说明书进行。400倍光学显微镜下观察,每张切片随机观察8个视野,胞浆或胞核有棕色颗粒者为c-fos阳性细胞。

1. 7 统计学处理

用SPSS 14. 0 forW indows软件进行统计。各组间比较采用方差分析,所有数据均以x?s表示,P<0. 05为组间差异具有统计学意义。

2 结 果

2. 1 形态学变化 缺血再灌注模型组缺血灶内大量细胞胞浆染成深棕色的c-fos阳性细胞,随再灌注时间增长,细胞排列紊乱,细胞周围间隙增宽,有大量缺血坏死神经元,胞体肿胀,胞浆淡染,胞核溶解,结构不清;给药组模型切片中的细胞形态相对完整、细胞间质比较均匀、致密,可见少量c-fos阳性细胞。

2.2 扶芳藤提取物对大鼠急性脑缺血再灌注后c-fos表达水平的影响 与假手术组比较,缺血再灌注模型组、给药组的c-fos在2、6、12、24 h时点的表达明显增高,差异有统计学意义(P均<0.01);但给药组在各时点的表达显著低于模型组,差异有统计学意义(P均<0.01),见表1。

表1 扶芳藤提取物对大鼠急性脑缺血再灌注后c-fos表达的影响(x?s,% )

Table 1 Effecton expression of c-fos in cerebral ischemia-reperfusion injury ratswith ExtractofEuonymus fortumei

组别2 h 6 h 12 h 24 h

假手术组1. 42?0. 69 1. 00?0. 58 0. 71?0. 49 0. 86?0. 69

模型组34. 00?2. 83 37. 00?5. 16 30. 43?3. 60 28. 86?4. 26

给药组13. 86?2. 97 14. 58?2. 76 9. 86?2. 34 9. 14?2. 97

3 讨 论

1982年,真核细胞基因组中的原癌基因c-fos被发现,这是一种即基因( immediate-early gene, IEG),其产物FOS蛋白参与细胞周期的调节,与细胞的生长、分化、死亡及损伤修复有关,其主要机制为FOS经广泛修饰后与另一种IEG c-jun所表达的核蛋白JUN形成转录激活蛋白1 ( activator protein 1,AP-1),AP-1能与DNA调节序列相结合,可被基因启动子或增强子序列识别并结合,从而参与细胞生长、分化等一系列病理生理过程。因此c-fos作为核内第三信使,在神经信号的传递中发挥重要作用。c-fos对缺血再灌注等外界刺激可迅速作出反应进行表达,是反映神经细胞功能状态的重要的因素,其基因产物c-fosmRNA和FOS作为细胞对缺血反应的敏感指标,可用来评价脑缺血后神经损伤程度,因此c-fos的表达可作为研究脑缺血后细胞代谢改变的一项新指标和测定药物对脑缺血干涉作用的新方法[4]。

正常情况下c-fos在脑内表达水平极低,脑缺血可诱导其大量表达, c-fos表达与脑缺血后神经元的死亡或凋亡呈平行关系,其表达程度反映了脑缺血后神经元死亡的程度, c-fos表达越高,相应的脑组织损伤越严重[5]。相关机制可能是因为c-fos的高度表达后形成的AP-1通过调控其下游基因,从而使一些维持细胞生存的蛋白合成减少,杀手蛋白合成增多引起[6]。

本实验证明扶芳藤提取物能明显减少c-fos的表达,提示扶芳藤提取物可能是通过抑制c-fos的表达,从而降低脑缺血区半暗带的细胞死亡率来实现其神经细胞保护功能。 因为影响c-fos表达的因素较多,如兴奋性氨基酸(EAA)受体激活和细胞内Ca2+增多,以及自由基的增多等等,那么,扶芳藤对脑缺血的保护作用是否是通过抑制上述因素的增多来发挥效应抑或是直接抑制于c-fos来发挥效应,还需进一步的研究与摸索。